REAGENTS

(R1) Formalina

La formalina è la soluzione acquosa di un gas, l'aldeide formica. E' disponibile in commercio a una concentrazione del 37-40%, per la sua diluizione deve essere considerata come soluzione pura. Nella soluzione commerciale è presente una quantità variabile di acido formico, che ostacola la fissazione dei parassiti, è dunque preferibile utilizzare formalina neutralizzata o tamponata.

FORMALINA NEUTRALIZZATA

Procedimento

-     Neutralizzare l'acido formico aggiungendo goccia a goccia NaOH N/10 sino a neutralità (verificare con cartina per pH o con pHmetro).

-     In genere per la fissazione di campioni di feci si utilizza una soluzione di formalina al 10% (per la fissazione di protozoi è consigliata una soluzione al 5%).

SOLUZIONE DI FORMALINA NEUTRALIZZATA AL 10%

Procedimento

-     Formalina neutralizzata                                         100 ml

-     Acqua distillata o soluzione fisiologica                     900 ml

Mescolare bene. Conservare in contenitore tappato

SOLUZIONE DI FORMALINA NEUTRALIZZATA AL 5%

Procedimento

-     Formalina neutralizzata                                           50 ml

-     Acqua distillata o soluzione fisiologica                     950 ml

Mescolare bene. Conservare in contenitore tappato

SOLUZIONE DI FORMALINA TAMPONATA AL 10%

Composizione

-     Sodio fosfato monobasico (NaH2PO4)                          4.0 g

-     Sodio fosfato di basico (Na2HPO4)                              6.5 g

-     Formalina commerciale (37%-40%)                           100 ml

-     Acqua distillata o soluzione fisiologica                       900 ml

Procedimento

-     Sciogliere i sali nell'acqua distillata

-     Aggiungere la formalina, miscelare bene

-     Conservare in contenitore tappato

SOLUZIONE DI FORMALINA TAMPONATA AL 5%

Composizione

-     Sodio fosfato monobasico (NaH2PO4)                          4.0 g

-     Sodio fosfato di basico (Na2HPO4)                              6.5 g

-     Formalina commerciale (37%-40%)                             50 ml

-     Acqua distillata o soluzione fisiologica                       950 ml

Procedimento

-     Sciogliere i sali nell'acqua distillata

-     Aggiungere la formalina, miscelare bene

-     Conservare in contenitore tappato

(R2) Soluzione Fisiologica

Composizione

-     NaCl                                                                     8.5 g

-     Acqua distillata                                                   1000 ml

Procedimento

-     Sciogliere il cloruro di sodio nell'acqua distillata, miscelare bene

-     conservare in contenitore ben tappato.

Le quantità di sale ed acqua possono essere proporzionalmente ridotti. Per garantire una migliore conservazione della soluzione procedere nel seguente modo:

-       distribuire aliquote di 10 ml della soluzione in provette di vetro provviste di tappo di chiusura;

-       sterilizzare in autoclave a 121°C per 15 minuti e lasciare raffreddare;

-       conservare a 4°C, utilizzare fino a esaurimento.

La soluzione fisiologica, deve essere rinnovata di frequente e conservata in contenitori tappati per evitare la contaminazione accidentale con spore vegetali, pollini, muffe o amebe a vita libera presenti nell'aria. Questi contaminanti possono essere erroneamente confusi con protozoi durante l'esame microscopico delle feci.

(R3) Soluzione di Saccarosio 

Procedimento

-     Sciogliere 500 g di saccarosio in 320 ml di acqua distillata riscaldando la soluzione (non portare all'ebollizione) finché diventa trasparente

-     Aggiungere con cautela 6,5 g di cristalli di fenolo (operazione da fare sotto cappa aspirante).

-     Mescolare bene. Conservare in contenitore tappato.

La soluzione è stabile sino ad esaurimento.

(R4) SAF (Sodio acetato-Acido acetico- Formalina) 

Composizione

-     Sodio acetato anidro (NaC2H3O2)                  9 g

-     Acido acetico glaciale                              20 ml

-     Formalina commerciale (37%-40%)            40 ml

-     Acqua distillata                                     925 ml

In alternativa a 9g di Sodio acetato anidro,si possono usare 15 g Sodio acetato idrato (CH3CO2Na ∙ 3H2O) 

Procedimento

-     Sciogliere il sale in acqua distillata

-     aggiungere la formalina e l'acido acetico glaciale, mescolare bene.

-     Aggiustare il pH a 4,15 se necessario.

Questa soluzione è stabile in bottiglia di vetro tappata per almeno 1 anno

Dovendo scegliere uno solo fissativo fra quelli esistenti in commercio, è consigliabile orientarsi sul SAF per i seguenti motivi:

·      non contiene composti a base di mercurio, è quindi più sicuro, meno corrosivo e meno inquinante per l'ambiente;

·      consente una buona conservazione della morfologia di cisti, uova e larve di elminti, oocisti di coccidi e spore di microsporidi - ma soprattutto un'ottima differenziazione della morfologia del nucleo dei trofozoiti di protozoi;

·      permette le procedure di concentrazione con formalina-etere/etile acetato e di flottazione con zinco solfato;

·      consente la ricerca di coproantigeni di parassiti e le colorazioni con fluorocromi;

·      consente l'esecuzione delle colorazioni permanenti con ferro-ematossilina (ottimi risultati) e con la colorazione tricromica di Gomori modificata da Wheatley;

·      consente la colorazione tricromica modificata per microsporidi;

·      è poco costoso e può essere preparato "in casa" senza difficoltà.

Svantaggi:

-     la qualità della colorazione tricromica è più scadente rispetto a quella ottenuta da campioni fissati in soluzione di Schaudinn o PVA;

-     a causa della bassa concentrazione di formalina, è obbligatorio rispettare come minimo il rapporto di 1 parte di feci e 3 parti di fissativo, pena la fermentazione del campione fecale.

(R5) Fissativo di Schaudinn

SOLUZIONE SATURA DI CLORURO MERCURICO(HgCl2)

Procedimento

-     Sciogliere a caldo 10 g di HgCl2 in 100 ml di acqua distillata (non bollente).

-     Lasciare raffreddare la soluzione (si deposita un eccesso di cristalli di cloruro mercurico).

-     Filtrare il sovranatante limpido.

-     Conservare in bottiglia di vetro tappata fino al momento dell'uso.

SOLUZIONE MADRE DI SCHAUDINN

Composizione

-     Soluzione satura di cloruro mercurico                  2 volumi

-     Alcol etilico 95%                                             1 volume

-     Mescolare bene.

SOLUZIONE DI LAVORO DI SCHAUDINN

-       Immediatamente prima dell'uso aggiungere 5,0 ml di acido acetico glaciale a 95,0 ml di soluzione madre.

-       Mescolare bene.

 

(R6) PVA (Alcol polivinilico – Cloruro mercurico)

L'alcol polivinilico è un polimero sintetico dell'alcol vinilico. Sul campione fissato in PVA e strisciato su vetrino, una volta asciutto, si forma un film plastico trasparente molto aderente, resistente all'azione di alcol, etere, xilene, acetone. Il fissativo vero e proprio è il cloruro mercurico, energico ossidante che precipita le proteine. Questa azione è esaltata dalla presenza dell'acido acetico.

SOLUZIONE DI PVA: 

Composizione

-     Soluzione madre di Schaudinn                                93.5 ml

-     Glicerina                                                             1.5 ml

-     Acido acetico glaciale                                            5.0 ml

-     Alcol polivinilico 90-50 (bassa o media viscosità)          5 g

Procedimento

-     Riscaldare questa miscela a 75° C a bagno maria (attenzione all'infiammabilità dell'alcol)

-     con continua agitazione, aggiungere lentamente 5 g di alcol polivinilico 90-50 a bassa o media viscosità; se possibile, utilizzare una piastra riscaldante con agitatore magnetico.

Durante il raffreddamento si può notare un leggero intorbidamento della soluzione che non ne pregiudica l'uso. La soluzione è stabile per almeno 1 anno se conservata in bottiglia di vetro chiusa; se con il passare del tempo diventa troppo viscosa, biancastra od opaca, non può essere più utilizzata.

Vantaggi:

-     è il fissativo per eccellenza per la colorazione tricromica con colorante di Gomori modificata da Wheatley.

Svantaggi:

-     il cloruro mercurico è un sale estremamente tossico sia per l'uomo che per l'ambiente e va smaltito come "rifiuto speciale";

-     la sua preparazione in laboratorio non è semplice, anche perché è difficile reperire in commercio alcol polivinilico di buona qualità. Se possibile, acquistare il fissativo da ditte commerciali;

-       a causa dell'elevato potere corrosivo del cloruro mercurico i preparati - prima della colorazione - non devono entrare in contatto con metalli, ad es. non vanno conservati in foglio di alluminio, pena lo sfaldamento e il distacco del campione dal vetrino;

-       è possibile la concentrazione con formalina etere/etile acetato del campione fissato in PVA, sebbene il numero di uova e cisti individuate sia decisamente inferiore in confronto allo stesso campione fissato in formalina. Nelle infestazioni con bassa carica parassitaria il risultato dell'esame può risultare negativo;

-       l'aggiunta di soluzione di Lugol per l'esame microscopico diretto può a volte causare un precipitato che rende difficoltosa l'osservazione microscopica.

A causa della tossicità del cloruro mercurico, si è tentata la sostituzione con solfato di rame o solfato di zinco. I risultati dimostrano che la morfologia nucleare e citoplasmatica non è paragonabile a quella ottenuta con il cloruro mercurico, inoltre in un certo numero di casi non è stato possibile riconoscere la morfologia di protozoi patogeni.

(R7) Soluzione di MIF (Mertiolato-Iodio-Formalina)

Questa soluzione permette di effettuare in modo contemporaneo la fissazione (formalina) e la colorazione di protozoi, grazie all'azione combinata di due coloranti (iodio ed eosina). Viene utilizzato soprattutto in indagini "sul campo".

Vantaggi:

-       in un esame a fresco delle feci può essere immediatamente diagnosticata la presenza di protozoi intestinali (trofozoiti e/o cisti), uova e larve di elminti. Il campione di feci, fissato e colorato, può essere esaminato anche dopo diverse settimane o mesi.

Svantaggi:

-       l'identificazione dei protozoi nei preparati è spesso difficoltosa, il personale deve avere molta preparazione ed esperienza;

-       è possibile eseguire le colorazioni permanenti ma la morfologia degli organismi non è così buona come quella dei campioni fissati in Schaudinn, PVA o SAF;

-       è necessario conservare separatamente le due soluzioni coloranti che vanno miscelate immediatamente prima dell'uso

-       la soluzione di iodio è instabile e dev'essere rinnovata di frequente ;

-       i risultati della colorazione variano con l'invecchiamento della soluzione;

-       le tecniche di concentrazione forniscono risultati contrastanti;

-       la tintura di Mertiolato (tintura di Mertiolato, contenente eosina, 1/1000) è difficilmente reperibile in commercio.

Soluzione di MIF per colorazione diretta a fresco

Composizione

-     Tintura di Mertiolato 1/1000 Lilly®                         7.75 ml

-     Soluzione di Lugol 5%                                          1.00 ml

-     Formalina 37-40%                                               1.25 ml

Questa soluzione è stabile al massimo per 8 ore, la quantità dei reattivi può essere ridotta proporzionalmente a seconda delle necessità. Per il suo utilizzo vedi: “Esame microscopico dopo colorazione estemporanea.”.

Soluzione di MIF per colorazione in provetta o per la conservazione dei campioni fecali

Composizione

Soluzione madre MF

-     Tintura di Mertiolato 1/1000 Lilly®                          200 ml

-     Formalina 37-40%                                                  25 ml

-     Glicerina                                                                5 ml

-     Acqua distillata                                                    250 ml

Mescolare bene. Conservare in bottiglia di vetro scuro tappata. La soluzione è stabile per parecchi mesi.

Soluzione di Lugol al 5%

Composizione

-     Iodio cristalli                                                            5 g

-     Ioduro di potassio (KI)                                             10 g

-     Acqua distillata                                                    100 ml

Procedimento

-     Sciogliere lo ioduro di potassio in 20-30 ml di acqua distillata

-     aggiungere poco alla volta i cristalli di iodio per ottenere una soluzione omogenea

-     Aggiungere la restante acqua, mescolare bene e filtrare.

-     Conservare in bottiglia di vetro scuro ben tappata  la soluzione è stabile per parecchie settimane.  

Soluzione di lavoro MIF

Composizione

-     Soluzione madre MF                                     2.35 ml

-     Soluzione di Lugol 5%                                  0.15 ml

Immediatamente prima dell'uso aggiungere la soluzione madre di MF alla soluzione di Lugol e non viceversa.   Per il suo utilizzo vedi: “Esame microscopico diretto dopo colorazione estemporanea.”.

(R8) Soluzione di Lugol 1% per esame diretto a fresco o dopo concentrazione con formalina-etere/etile acetato.

Composizione

-     Iodio cristalli                                                              2 g

-     Ioduro di potassio (KI)                                                 2 g

-     Acqua distillata                                                      100 ml

Procedimento

-     Sciogliere lo ioduro di potassio in 20-30 ml di acqua distillata

-     aggiungere poco alla volta i cristalli di iodio per ottenere una soluzione omogenea

-     Aggiungere la restante acqua, mescolare bene e filtrare.

Questa soluzione è stabile e mantiene il suo potere colorante al massimo per 1 mese se conservata in bottiglia di vetro scuro tappata e al riparo dalla luce. In commercio è disponibile la soluzione di Lugol 1% stabilizzata con PVP (polivinil-pirrolidone) pronta all'uso; è garantita una stabilità superiore (1 anno). Per il suo utilizzo vedi: “Esame microscopico dopo colorazione estemporanea. ”.

(R9) Soluzione di Lugol 1% con glicerina

Composizione

-     Soluzione di Lugol 1% (o soluzione di Lugol 1% (PVP)) 100 ml

-     Glicerina                                                              0.25 ml

Miscelare bene. Per la conservazione e la stabilità vedere (R8).

Per il suo utilizzo vedi: Esame microscopico dopo colorazione estemporanea.

(R10) Soluzione di Bailenger (cristal violetto-fucsina)

Composizione

-     Cristal violetto                                                         2.0 g

-     Fucsina basica                                                       0.05 g

-     Alcol etilico 95%                                                  10.0 ml

-     Fenolo cristallizzato*                                             10.0 ml

* fondere a bagno maria a 56 °C sotto cappa aspirante.

Procedimento

-     Miscelare bene i reattivi

-     lasciare a contatto tutta la notte

-     aggiungere 100 ml acqua distillata

-     Mescolare bene e filtrare.

La soluzione deve essere conservata in un flacone di vetro scuro ermeticamente chiuso e al riparo della luce. Al momento dell'uso non agitare assolutamente il flacone, ma prelevare con una pipetta lo strato superiore della soluzione.   Per il suo utilizzo vedi “Esame microscopico diretto dopo colorazione estemporanea.”.

(R11) Soluzione colorante di Sargeaunt (colorazione dei corpi cromatoidi).

Composizione

-     Verde di malachite                                                         0.2 g

-     Acido acetico glaciale                                                   3.0 ml

-     Alcol etilico 95%                                                         3.0 ml

Procedimento

-     Sciogliere il verde di malachite nell'alcol

-     aggiungere l'acido acetico

-     portare a volume con acqua distillata fino a raggiungere 100 ml.

La soluzione ha una buona stabilità se conservata a temperatura ambiente. Per il suo utilizzo vedi:   Esame microscopico diretto dopo concentrazione.

(R12) Soluzione di Merbromina

Composizione

-     Merbromina                                                               2 g

-     Acqua distillata                                                      100 ml

Procedimento

-     Sciogliere la Merbromina in acqua distillata,mescolare bene

-     Conservare a temperatura ambiente

La soluzione è stabile per 1 anno.

(R13) Soluzione di Nigrosina

Composizione

-     Nigrosina                                                                1 g

-     Acqua distillata                                                    100 ml

Procedimento

-     Sciogliere la Nigrosina in acqua distillata, mescolare bene

-     Conservare a temperatura ambiente

La soluzione è stabile per 1 anno.

(R14) Alcol iodato

Aggiungere ad alcol etilico 70% una quantità sufficiente di soluzione di iodio al 5% in modo tale da ottenere una colorazione "tè forte". Questa soluzione dev'essere sostituita quando il colore tende a ingiallire. La sua durata dipende dal numero degli strisci colorati ( da 1 a parecchie settimane).

(R15) Colorante tricromico

Composizione

-     Cromotrope 2R                                                       0.6 g

-     Verde luce SF                                                         0.3 g

-     Acido fosfotungstico                                                0.7 g

-     Acido acetico glaciale                                             1.0 ml

-     Acqua distillata                                                   100.0 ml

Procedimento

-     Trasferire le polveri in un contenitore di vetro da 250 ml

-     aggiungere l'acido acetico in modo che le polveri siano completamente bagnate. Lasciare a contatto per 30 minuti;

-     Aggiungere l'acqua distillata e mescolare con cura.

-     Conservare in bottiglia di vetro scuro al riparo dalla luce.

La soluzione è stabile per almeno 1 anno se conservata a temperatura ambiente. Questa soluzione è disponibile in commercio pronta all'uso.

(R16) Soluzione decolorante

Composizione

-     Acido acetico glaciale                                           0.5 ml

-     Alcol etilico 90%                                                99.5 ml

Non sostituire l'alcol 90% con alcol 95%, per evitare un eccessivo effetto decolorante.

(R17) Albumina di Mayer 

Procedimento

-     Mescolare parti uguali di glicerina e albume di uovo fresco.

-     Filtrare la miscela su garza

-     Aggiungere alcuni cristalli di timolo come conservante.

-     Conservare in frigorifero.

-     Mescolare bene per inversione prima dell'uso.

Stabile almeno per 1 anno.

(R18) Ematossilina di Heidenhain soluzione A

Composizione

-     Ematossilina cristalli                                                  10 g

-     Alcol etilico 95%                                                  1000 ml

Procedimento

-     Sciogliere l'ematossilina nell'alcol in un contenitore di vetro chiaro

-     tappare, lasciare ossidare cioè "maturare" la soluzione esponendola alla luce solare non diretta per almeno 6-8 settimane. Un'esposizione più prolungata (mesi, sino a due anni!) aumenta il potere colorante della soluzione.

(R19) Soluzione mordenzante di allume ferrico soluzione B

Composizione

-     Ammonio solfato ferroso(NH4)2(SO4)2 6H2O             10 g

-     Ammonio solfato ferrico FeNH4(SO4) 12H2O            10 g

-     Acido cloridrico conc.37%                                  10 ml

-     Acqua distillata                                              1000 ml

Procedimento

-     Sciogliere i due sali in acqua distillata

-     aggiungere lentamente l'acido cloridrico.

-     Conservare a temperatura ambiente ( meglio in frigorifero) in contenitore di vetro scuro.

(R20) Soluzione di lavoro di ematossilina di Heidenhain

Procedimento

-     Mescolare parti uguali della soluzione A (R18) e B (R19), filtrare

-     lasciare maturare a temperatura ambiente almeno quattro ore (meglio una notte) prima dell'uso.

Se la soluzione viene utilizzata immediatamente dopo la preparazione, i parassiti si colorano in blu intenso con scarsa differenziazione dei dettagli nucleari. I migliori risultati si ottengono dopo tre-quattro giorni dalla preparazione della soluzione di lavoro.  

La stabilità della soluzione è di almeno una settimana, ma può essere prolungata conservandola dopo l'uso in un flacone tappato di vetro scuro. Si può verificare in questo modo se la soluzione è ancora valida:

-       in una provetta contenente acqua di fonte, aggiungere due gocce di ammonio idrossido;

-       aggiungere un paio di gocce di soluzione di lavoro di ematossilina

-      se il colore risultante è blu o blu nero la soluzione di lavoro può essere utilizzata, in caso contrario (colore marrone, brunastro) la soluzione deve essere sostituita.

(R21) Soluzione decolorante 1

Composizione

-     Alcol etilico 95%                                        70 ml

-     Acqua distillata                                          30 ml

-     Acido cloridrico conc.                                  1 ml

Mescolare bene.

(R22) Soluzione decolorante 2

Composizione

-     Soluzione mordenzante di allume ferrino (R19)                  5 ml

-     Acqua distillata                                                          95 ml

Mescolare bene.  Questa soluzione non può essere conservata, dev'essere preparata per ogni nuova colorazione.

(R23) Ematossilina di Mayer

Composizione

-     Ematossilina cristalli                                                   1 g

-     Allume di potassio                                                    50 g

-     Iodato di sodio (NaIO3)                                          0.20 g

-     Cloralio idrato                                                         50 g

-     Acqua distillata                                                   1000 ml

Procedimento

­       Si sciolgono a caldo (~90 °C) l'ematossilina e l'allume di potassio in 500 ml di acqua distillata.

­       Quando la soluzione si è raffreddata aggiungere lo iodato di sodio sciolto in 50 ml di acqua distillata e il cloralio idrato sciolto in 450 ml di acqua distillata.

­       Lasciare maturare la soluzione in termostato per 48 ore a 48-50 °C

­       Trascorso questo periodo, togliere il contenitore dal termostato e lasciar raffreddare la soluzione mescolando su agitatore magnetico per circa due ore; la miscelazione dev'essere lenta, omogenea e deve avvenire a contenitore scoperto.

­       Aggiungere 5 ml di acido acetico glaciale e mescolare bene.

­       Filtrare prima del suo utilizzo

La soluzione di ematossilina di Mayer è stabile per almeno un anno se conservata in bottiglia di vetro scura a temperatura ambiente (20-25°C). 

In commercio sono disponibili soluzioni di ematossilina (Heidenhain, Mayer), ma spesso non sono fatte "maturare" (ossidare) a sufficienza; ne risulta una debole colorazione dei parassiti, con scarsa differenziazione dei dettagli nucleari.

(R24) Soluzione di acqua ammoniacale

Procedimento

-     Aggiungere a 100 ml di acqua distillata 8 gocce di ammoniaca concentrata

-     Mescolare bene.

(R25) Colorazione di Ziehl-Neelsen modificata per coccidi (metodo a caldo)

Soluzione A

-      Fucsina basica                                                            0.3 g

-      Alcol etilico 95%                                                        10 ml

Sciogliere la fucsina in etanolo, mescolare bene

Soluzione B

-      Fenolo cristalli                                                         5.0 g

-      Acqua distillata                                                   100.0 ml

Sciogliere i cristalli di fenolo in acqua distillata (in bagno maria a 56 °C sotto cappa aspirante).

Soluzione di lavoro di Carbol fucsina

Mescolare le soluzioni A e B, conservare a temperatura ambiente, stabile per 1 anno.

(R26) Soluzione decolorante acida

Composizione

-      Acido cloridrico 37%                              3 ml

-      Acqua distillata                                    97 ml

Aggiungere goccia a goccia l'acido all'acqua (e non l'inverso!!), miscelare bene.

(R27) Soluzione di Blu di metilene (colorante di contrasto)

Composizione

-     Blu di metilene                                                         0.3 g

-     Acqua distillata                                                       100 ml

Sciogliere il colorante in acqua distillata. Mescolare bene.

Conservare a temperatura ambiente. La soluzione è stabile per 1 anno.

(R28) Colorazione di Kinyoun per coccidi (metodo a freddo)

Soluzione A

-     Fucsina basica                                                        4 g

-     Alcol etilico 95%                                                20 ml

Sciogliere la fucsina in etanolo. Mescolare bene.

Soluzione B

-     Fenolo cristalli fuso a bagno maria (56 °C)                  8 ml

(sotto cappa aspirante)

Procedimento

-     Mescolare la soluzione A e B;

-     aggiungere 100 ml di acqua distillata miscelare bene

-     lasciare riposare per 1-2 giorni

-     Filtrare, conservare in bottiglia di vetro scuro: stabile indefinitamente.

(R29) Soluzione decolorante acida

Composizione

-     Acido solforico conc.                                          1 ml

-     Acqua distillata                                                 99 ml

Aggiungere goccia a goccia l'acido all'acqua (e non l'inverso!!), miscelare bene.

(R30) Soluzione di Blu di metilene (colorante di contrasto)

Composizione

-     Blu di metilene                                                          0.3 g

-     Acqua distillata                                                       100 ml

Sciogliere il colorante in acqua distillata, miscelare bene.

Conservare a temperatura ambiente. La soluzione è stabile per 1 anno.

(R31) Soluzione colorante tricromico per microsporidi

Composizione

-     Chromotrope 2R                                                      6.0 g

-     Fast green FCF                                                      0.15 g

-     Acido fosfotungstico                                               0.70 g

-     Acido acetico glaciale                                              3.0 ml

-     Acqua distillata                                                    100.0 ml

Rispetto al colorante tricromico di Wheatley, la concentrazione di Chromotrope 2R è dieci volte superiore. Per la preparazione vedi colorante tricromico

(R32) Soluzione alcol acida

Composizione

-     Alcol etilico 90%                                                     995.5 ml

-     Acido acetico glaciale                                                    4.5 ml

Mescolare bene, conservare in contenitore tappato.

(R33) Soluzione di Giemsa al 10%

Composizione

-     Colorante di Giemsa (soluzione madre)                         10 ml

-     Acqua tamponata a pH 7,2                                          90 ml

Mescolare bene.

La soluzione è stabile per 12 ore a temperatura ambiente.

La soluzione madre di Giemsa esiste in commercio pronta all'uso. Vista la sua instabilità, è preferibile acquistare confezioni di volume ridotto (100-250 ml) da conservare a temperatura ambiente, al riparo dalla luce e perfettamente chiuse.

Non agitare il flacone prima dell'uso: si rischia che i cristalli di colorante non disciolto ritornino in sospensione e si depositino sul preparato durante la colorazione.

Non prelevare il colorante con alcun tipo di pipetta, di plastica o di vetro, ma versarne una piccola quantità in un contenitore perfettamente pulito e asciutto; da quest'ultimo prelevare la quantità necessaria con una pipetta graduata. Il colorante non utilizzato dev'essere gettato e non va assolutamente rimesso nel flacone originale.

Acqua tamponata a pH 7,2

Soluzione tampone concentrata

-     KH2PO4                                                                  2.69 g

-     Na2HPO4                                                                8.36 g

-     Acqua distillata                                                       100 ml

Sciogliere i sali in acqua distillata. Mescolare bene.

Procedimento

-     Mescolare 20 ml di soluzione tampone concentrata con 1000 ml di Acqua distillata

-     Verificare il pH con cartina indicatrice o meglio con pHmetro

Sono reperibili in commercio acque minerali con diversi valori di pH. Si può sostituirne l'acqua tamponata scegliendone una del commercio, che sia non gasata e con un pH dichiarato di 7,2.

(R34) Colorante di Field

Field A

-     Blu di metilene                                                         0.80 g

-     Azur 1                                                                   0.50 g

-     Na2HPO4                                                                5.00 g

-     KH2PO4                                                                  6.25 g

-     Acqua distillata                                                        500 ml

Procedimento

-     Sciogliere i sali in acqua distillata a caldo

-     lasciar raffreddare, aggiungere i coloranti.

-     Lasciar maturare per 24 ore;

-     filtrare su carta bibula,

-     conservare a temperatura ambiente al riparo dalla luce.

-     Stabilità circa 12 mesi.

Field B

-     Eosina                                                                  1.00 g

-     Na2HPO4                                                               5.00 g

-     KH2PO4                                                                6.25 g

-     Acqua distillata                                                      500 ml

Procedimento

-     Sciogliere i sali in acqua distillata a caldo;

-     lasciar raffreddare e aggiungere il colorante.

-     Lasciar maturare per 24 ore

-     filtrare su carta bibula

-     conservare a temperatura ambiente al riparo dalla luce;

-     Stabilità circa 12 mesi.

Le soluzioni Field A e Field B sono reperibili in commercio pronte all'uso.

(R35) Calcolo dell' accellarazione di gravità (g)

g = r x (giri/min.)2 x 1,118 x 10-5

dove r è il raggio della centrifuga espresso in centimetri