THE MICROSCOPE

RICERCA DI PARASSITI NEI CAMPIONI FECALI

La fase pre-analitica dell'esame parassitologico delle feci per la ricerca microscopica dei protozoi intestinali e di microsporidi è simile a quella per la ricerca di altri parassiti (elminti) nelle feci e comprende la conoscenza di:

-     Antecedenti epidemiologici:  Luogo di residenza, provenienza, tenore di vita, abitudini alimentari e comportamentali, tipo di approvvigionamento idrico, trattamento ed eliminazione delle deiezioni umane ed animali, convivenza con animali, viaggi all'estero, "Unde venis ?".

-     Antecedenti clinici. Segni e sintomi clinici possono caratterizzare alcune parassitosi. Sarà utile conoscere le malattie di base e la presenza di: diarrea (tipo, evoluzione), prurito anale, prurito generalizzato, anoressia, dimagrimento, vomito, affezioni respiratorie, quadro febbrile (durata, andamento), epatosplenomegalia, adenopatia, ecc..

-     Ciclo biologico del parassita. Nei protozoi intestinali (amebe e flagellati) il periodo di prepatenza ha in genere una durata di pochi giorni e al massimo di 2-3 settimane, a differenza degli elminti, nei quali può variare da poche settimane ad alcuni mesi. Il periodo di prepatenza è il tempo che intercorre dall'ingresso dello stadio infettivo del parassita nell'organismo al momento in cui il parassita o i suoi prodotti possono essere rilevati mediante procedure diagnostiche nelle feci, nel sangue o in altri "excreta". Il periodo di incubazione è il tempo che intercorre dall'ingresso dello stadio infettivo del parassita nell'organismo al manifestarsi dei sintomi clinici dell'infezione.

Preparazione del paziente

Durante la settimana antecedente la raccolta dei campioni di feci, il paziente deve astenersi dall'assunzione di medicinali a base di carbone vegetale, sali di bario, magnesio, bismuto o di olii purgativi: la presenza di queste sostanze rende difficoltoso l'esame microscopico. Anche la terapia antibiotica, inibendo la flora batterica intestinale, può provocare una diminuzione del numero di protozoi (i protozoi si nutrono di batteri).

Per facilitare il compito all'esaminatore, sia durante la raccolta delle feci sia durante i tre giorni che la precedono, viene consigliata una dieta priva di residui alimentari che possano generare confusione (falsi parassiti) o rendere difficoltoso l'allestimento dei preparati microscopici:

Evitare l'assunzione di:

-     tutti i tipi di legumi;

-     frutta in generale e soprattutto quella con cuticola resistente;

-     granaglie;

-     vegetali le cui foglie contengono concrezioni dure;

-     funghi;

-     miele;

-     tisane e in generale prodotti di fitoterapia.

Per quanto riguarda i farmaci, è consigliabile sospenderli, tranne quelli per patologie importanti, che comunque sono da segnalare.

RACCOLTA DEI CAMPIONI

Le feci devono essere raccolte in un contenitore pulito e asciutto, a bocca larga e provvisto di tappo di chiusura. Evitare di raccogliere il campione dalla tazza del water, perché la contaminazione con urina inibisce la mobilità dei trofozoiti, mentre l'acqua può contenere amebe a vita libera in grado di causare errori di diagnosi.

Nelle indagini epidemiologiche è in genere esaminato un solo campione, ma in altri casi questo non è sufficiente. Poiché l'eliminazione dei parassiti non è continua è può presentare una fase di eclissi, viene raccomandata la raccolta di 3 campioni, in giorni non consecutivi e al massimo nell'arco di 10 giorni. E' vivamente sconsigliato di riunire i 3 prelievi in un unico campione, in quanto i parassiti - eventualmente presenti in un solo campione - verrebbero inutilmente diluiti, con una significativa diminuzione della sensibilità dell'esame.

Nel sospetto di amebiasi, giardiasi o microsporidiosi può essere necessario esaminare più campioni raccolti in un periodo di 7-10 giorni allo scopo di aumentare la sensibilità dell'esame. L'esame microscopico a fresco per la ricerca di forme mobili di trofozoiti in campioni di feci diarroiche va effettuato, se possibile, immediatamente o entro 30 minuti dalla loro emissione. Dopo questo intervallo di tempo, i trofozoiti eventualmente presenti si immobilizzano e iniziano processi di degenerazione che li rendono difficilmente identificabili o irriconoscibili.

Nella colite amebica possono formarsi ulcere nella porzione retto-sigmoidea del colon e in tal caso i parassiti tendono ad essere più numerosi sulla superficie piuttosto che all'interno del campione; è allora importante raccogliere ed esaminare immediatamente anche le porzioni sanguinolente ed il muco eventualmente presente.

Il limiti di tempo raccomandati per l'esame microscopico diretto sono:

-     Feci liquide e diarroiche (esaminare entro 30 minuti dall'emissione)

-     Feci poltacee (esaminare entro 1 ora dall'emissione)

-     Feci formate (esaminare entro 24 ore dall'emissione)

Se questi tempi non possono essere rispettati fissare immediatamente una parte del campione in opportuno fissativo mentre il rimanente viene conservato in frigorifero a 4 °C (mai in termostato).

FISSAZIONE DEL CAMPIONE

Il trattamento del campione con un fissativo, con il quale le feci vanno accuratamente omogeneizzate immediatamente dopo l'evacuazione (dal paziente stesso), permette di mantenere inalterata la morfologia dei parassiti. Dilazionare il trattamento del campione con il fissativo porta alla perdita dei dettagli morfologici dei parassiti; nel caso delle colorazioni permanenti il risultato può essere particolarmente deludente. Qualunque sia il tipo di fissativo utilizzato (formalina, SAF, PVA), deve sempre essere rispettato un rapporto minimo di tre parti di fissativo per una parte di campione.

ESAME MACROSCOPICO E MICROSCOPICO DEI CAMPIONI FECALI  

-     Esame macroscopico

-     Esame microscopico

•      diretto con soluzione fisiologica

•      dopo colorazione estemporanea

     con soluzione di Lugol

     con soluzione MIF

     con soluzione di Bailenger stain

     con soluzione di Sargeaunt

     con soluzione di merbromina/nigrosina

     Nigrosin solution

•      dopo concentrazione

     metodo bifasico di Ritchie

     metodo di Junod per la concentrazione di trofozoiti

     metodo di flottazione sedimentazione sec. Sheather

•      dopo colorazione permanente

     tricromica

     ematossilina

     Giemsa, Field

     Ziehl-Neelsen mod., Kinyoun

     tricromica mod. per microsporidi

-     con microscopio a fluorescenza (autofluorescenza)

ESAME MACROSCOPICO

Questo tipo di esame viene eseguito su feci cui non è stato aggiunto alcun tipo di fissativo; per la sua idonea esecuzione, vedi quanto detto a proposito della raccolta e conservazione del campione. Dovrà essere individuata la presenza di muco, specie se sanguinolento, per esaminarlo direttamente al microscopio per la ricerca di forme vegetative di trofozoiti.

ESAME MICROSCOPICO DIRETTO CON SOLUZIONE FISIOLOGICA

Questo tipo di esame è utilizzato principalmente per valutare il tipo di mobilità di trofozoiti di amebe e flagellati in campioni di feci dissenteriche liquide o pastose. E' possibile inoltre osservare uova e/o larve di elminti, cisti di protozoi e oocisti di coccidi, sebbene queste forme sono meglio rilevate dopo concentrazione delle feci.

Procedimento:

-     su un vetrino porta oggetto diluire una piccola quantità di feci (circa 2 mg) con soluzione fisiologica (R2) e miscelare bene;

-     tenendo il vetrino coprioggetto inclinato toccare il margine della goccia e abbassarlo delicatamente sul portaoggetto in modo da evitare la formazione di bolle.

La densità della sospensione deve essere tale da poter leggere attraverso il preparato i caratteri di stampa di un giornale. Le porzioni muco sanguinolente non devono essere diluite, vanno solo premute delicatamente con il coprioggetto. Esaminare tutto il preparato e specialmente le parti mucose, in quanto i trofozoiti possono essere intrappolati in alcune zone, mentre altrove, soprattutto nella parte liquida o nelle particelle fecali, possono essere del tutto assenti. Queste raccomandazioni valgono anche per campioni raccolti durante la retto-sigmoidoscopia. 

Regolare il microscopio correttamente (distanza interpupillare, regolazione diottrica, regolazione dell'illuminazione secondo Köhler), mettere a fuoco con la vite macrometrica e successivamente focheggiare con la vite micrometrica, esaminare tutto il preparato in maniera sistematica, "come il contadino che ara un campo".

L'esame a piccolo ingrandimento (obiettivo 10X) va eseguito regolando il reostato dell'illuminazione verso il minimo; le forme sospette di protozoi sono invece da esaminare a maggiore ingrandimento (obiettivo 40X) aumentando l'intensità della sorgente luminosa. Il diaframma del condensatore non deve essere chiuso eccessivamente poiché l'aumento di profondità di campo e di contrasto sono solo apparenti: in realtà, chiudendolo eccessivamente, si ottiene solamente una drastica riduzione del potere di risoluzione dell'obbiettivo.

Il preparato deve essere esaminato immediatamente per poter valutare il tipo di mobilità dei trofozoiti: si evita così anche l'evaporazione della sospensione fecale e la formazione di bolle di aria che ostacolano l'osservazione microscopica. In alternativa il preparato può essere conservato per alcune ore sigillando i bordi del copri oggetto con smalto per unghie per evitare la disidratazione. Data la piccola quantità di feci esaminata il risultato dell'esame può essere negativo, soprattutto se la concentrazione di parassiti nel campione è bassa.

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ESAME MICROSCOPICO DIRETTO CON COLORAZIONE ESTEMPORANEA

Colorazione con soluzione di Lugol all' 1%

L'allestimento del preparato viene effettuato con le modalità descritte in precedenza, sostituendo la soluzione fisiologica con quella di Lugol (R8). Mescolare immediatamente in quanto la soluzione di Lugol provoca la coagulazione della sospensione fecale.

Questa colorazione fornisce i migliori risultati con feci fresche, non fissate in formalina. Le strutture nucleari (cromatina nucleare e cariosoma), le fibrille dei flagellati, assumono un colore giallo bruno e diventano ben evidenti; i vacuoli, o le masse iodofile, si colorano intensamente in marrone. Anche i residui alimentari si colorano, in particolare l'amido non completamente digerito si colora in viola o nero, mentre quello ben digerito in rosa. Per ottenere una colorazione più contrastata è opportuno non eccedere con la quantità di Lugol. Con il passar del tempo (< 10 min.) il preparato tende ad asciugarsi, rendendo difficile l'osservazione microscopica. Per ovviare a questo inconveniente è preferibile utilizzare la soluzione di Lugol con glicerina (R9), che rende il preparato perfettamente visibile per 2 giorni.

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Colorazione con soluzione di MIF

Colorazione diretta su vetrino:

-     Diluire circa 2 mg di feci con soluzione fisiologica in modo tale da ottenere un preparato più spesso rispetto all'esame diretto;

-     aggiungere una goccia di soluzione di MIF (R7a) e miscelare bene con un vetrino coprioggetto

Con campioni fissati in formalina o dopo concentrazione con formalina/etere o formalina etile/acetato, i risultati della colorazione sono talvolta deludenti.

Colorazione in provetta

-     Preparare una provetta contenente la soluzione di lavoro di MIF(R7b);

-     aggiungere una quantità di feci fresche pari a un pisello (~ 0,25gr.) e miscelare bene con un bastoncino di vetro o plastica;

-     lasciare riposare la miscela sino alla formazione di un sedimento e, prelevando con una pipetta una goccia dello strato superiore del sedimento, allestire un preparato microscopico;

-     la provetta contenente il campione viene tappata e, se nei giorni successivi si vuole esaminare il campione, è sufficiente rimettere in sospensione il sedimento per inversione, lasciare depositare per 15-20 minuti e allestire un nuovo preparato;

-     la soluzione di MIF permette la fissazione e la colorazione contemporanea di trofozoiti, cisti di protozoi e uova di elminti; aumentando nel giusto rapporto soluzione colorante e feci è possibile conservare grosse quantità di campioni, ad esempio per uso didattico

Lettura e interpretazione.

Esaminare tutto il preparato con obiettivo 10 x e 40 x. Le forme vegetative di amebe e flagellati si colorano in giallo o marrone chiaro, le cisti appaiono rifrangenti e incolori su fondo rosso-rosa, la membrana nucleare marrone-nero. Col passare del tempo l'azione dello iodio diminuisce progressivamente, le cisti assumono una colorazione rosata e la colorazione marrone dei vacuoli iodofili tende a scomparire.

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Colorazione con soluzione di Bailenger

-     Su di un vetrino porta oggetto miscelare una goccia di sospensione fecale (fisiologica, formalina o SAF) o una goccia di sedimento ottenuto per concentrazione con una piccola quantità (5μl !) di soluzione di Bailenger (R10);

-     coprire con vetrino coprioggetto.

Lettura e interpretazione.

Osservare il preparato con obiettivo 10x e 40x. La colorazione è immediata per i trofozoiti mentre le cisti, soprattutto quelle mature, assumono il colorante più lentamente. La piccola quantità di colorante non diluisce il preparato e permette inoltre una colorazione lentamente progressiva. Il citoplasma ed i corpi cromatoidi si colorano di rosso-viola, le strutture nucleari e i residui flagellari di viola scuro o nero. I nuclei dei trofozoiti di Dientamoeba fragilis non si colorano.

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Colorazione con soluzione di Sargeaunt

E' una colorazione estemporanea per i corpi cromatoidi delle cisti di ameba. Va eseguita solo su sedimento fecale ottenuto per concentrazione con il metodo di Ritchie utilizzando etere etilico (e non etile acetato).

-     Miscelare una goccia di sedimento fecale ed una goccia di soluzione di Sargeaunt (R11) su un vetrino porta oggetto

-     coprire con vetrino copri oggetto.

Lettura e interpretazione

Osservare il preparato con obiettivo 40X. Nelle cisti di ameba i corpi cromatoidi si colorano in verde scuro mentre i nuclei e il citoplasma assumono un colore verde chiaro

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Colorazione con soluzione di Merbromina

Colorazione estemporanea per la ricerca di oocisti di Cryptosporidium.

-     Su un vetrino porta oggetto miscelare una goccia di sedimento fecale ottenuto per concentrazione e una goccia di soluzione di merbromina (R12);

-     con l'aiuto di un bastocino formare uno striscio sottile ed uniforme su un'area equivalente a circa la metà del vetrino copri oggetto;

-     lasciare asciugare sino a quasi completo essiccamento;

-     aggiungere una o due gocce di olio per immersione e coprire con un copri oggetto di dimensioni adeguate.

Lettura e interpretazione

Osservare il preparato a 40X e a 100X. Le oocisti appaiono incolori su fondo rosso-rosa. Il preparato può essere allestito anche utilizzando feci fresche o fissate in formalina o SAF.

Colorazione con soluzione di Nigrosina (R13)

Colorazione estemporanea per la ricerca di oocisti di Cryptosporidium. Le modalità sono le stesse della colorazione con merbromina; le oocisti appaiono incolori su fondo nero.

ESAME MICROSCOPICO DOPO CONCENTRAZIONE

Se nel campione è presente un numero scarso di parassiti, l'esame microscopico diretto può fornire un risultato negativo: è quindi opportuno procedere con un metodo di concentrazione. In letteratura sono riportate diverse metodiche: è generalmente preferibile quella difasica di Ritchie e, per la ricerca delle oocisti di Cryptosporidium sp, il metodo di flottazione- sedimentazione sec. Sheather.

Metodo di concentrazione difasico di Ritchie (modificato)

Utilizzato presso il Servizio di Epidemiologia e Laboratorio per le Malattie Tropicali dell'Ospedale Sacro Cuore - Don Calabria di Negrar, Verona. Si utilizzano campioni di feci fresche, fissati in formalina o SAF.

Campione di feci fresche

Prelevare in più punti del campione (sia dalla parte esterna che da quella interna) una quantità di feci grossa come una noce. Aggiungere poco alla volta formalina al 10% o 5%, o SAF, miscelando bene in modo tale da ottenere una consistenza semi liquida del campione. Fissare per almeno 30 minuti.

Campione fissato in formalina o SAF.

Miscelare con cura il campione con un bastoncino di plastica o vetro e verificare la consistenza della sospensione fecale. Se troppo densa, aggiungere altro fissativo e miscelare nuovamente sino ad ottenere una consistenza semi liquida del campione.

ELIMINAZIONE DEI RESIDUI GROSSOLANI

1-   Filtrare la sospensione attraverso uno strato semplice di garza chirurgica inumidito con soluzione fisiologica e adagiato su un imbuto in una provetta conica da centrifuga, di vetro o di plastica (resistente all'etere), da 15 ml. La quantità di sospensione filtrata dev'essere circa 12 ml.

2-   Centrifugare per 3 min. a 500 x g.

3-   Eliminare il sovranatante e verificare la quantità di sedimento ottenuto: deve essere circa 2 ml; se non lo è, filtrare un'ulteriore quantità di sospensione fecale e centrifugare nuovamente.

In alternativa alla filtrazione su garza, si può lasciare sedimentare spontaneamente la sospensione in provetta per meno di 1 minuto e travasare quindi il sovranatante in un'altra provetta; procedere poi dal punto 2.

ELIMINAZIONE DELLE SOSTANZE SOLUBILI IN ACQUA

4-   Ottenuta la giusta quantità di sedimento aggiungere soluzione fisiologica e risospendere; centrifugare poi nuovamente come al punto 2. Ripetere questa operazione sino a che il sovranatante non è limpido.

ELIMINAZIONE DELLE SOSTANZE GRASSE

5-   Dopo avere eliminato il sovranatante dell'ultima centrifugazione, risospendere il sedimento con 10 ml di soluzione fisiologica, aggiungere 3 ml di etere etilico, tappare con tappo di plastica e, con energico movimento dall'alto verso il basso, agitare per almeno 30 sec. Togliere con cautela il tappo per evitare spruzzi di materiale (per la pressione dovuta all'etere) e centrifugare immediatamente per 3 min. a 500 g.

6-   Al termine della centrifugazione saranno visibili nella provetta quattro strati: dall'alto, l'etere colorato in giallo o giallo bruno, il tappo di detriti fecali, uno strato di sol.fisiologica-formalina e infine il sedimento fecale.

7-   Tenendo la provetta in posizione verticale, staccare delicatamente con un bastoncino di plastica o vetro il tappo di detriti fecali dalla parete; a questo punto capovolgere la provetta con un movimento deciso, in modo da eliminare i tre strati superiori. Riporre immediatamente la provetta in posizione verticale e risospendere il sedimento con alcune gocce di formalina (non troppa, per non diluire inutilmente il sedimento in cui sono concentrati i parassiti!).

Lettura: Vedi Esame microscopico diretto.

L'etere etilico può essere sostituito da etile acetato. L'etile acetato è meno infiammabile e quindi più sicuro, inoltre è più efficiente rispetto all'etere etilico per la concentrazione di cisti di Giardia sp.(ma anche uova di Taenia sp. e Hymenolepis nana), queste infatti sono trattenute più difficilmente nel tappo di detriti fecali. Tuttavia l'uso dell'etile acetato per l'estrazione delle sostanze grasse e del muco fornisce preparati meno trasparenti e quindi meno leggibili. Il limite del metodo di Ritchie consiste in una concentrazione poco efficiente delle forme vegetative dei protozoi intestinali.

Concentrazione dei trofozoiti da campioni di feci fissate in SAF

Il metodo originale proposto da L. Junod nel 1972 prevede:

-     fissazione dei trofozoiti e differenziazione della strutture nucleari in SAF;

-     flottazione dei trofozoiti in una soluzione di iodomercurato di potassio con densità 1,20;

-     precipitazione dei trofozoiti in una soluzione a bassa densità.

Senza richiedere alcun tipo di colorazione, questo metodo fornisce risultati eccellenti sia per la concentrazione dei trofozoiti, sia per la differenziazione dei nuclei di tutte le specie di ameba,. Tuttavia lo iodomercurato di potassio è molto tossico per inalazione, contatto con la pelle e ingestione e inoltre pericoloso per l'ambiente. In alternativa si può pertanto procedere con un metodo alternativo che, pur non concentrando i trofozoiti, fornisce preparati chiaramente leggibili:

-     miscelare con cura il campione fissato in SAF e lasciare sedimentare spontaneamente in provetta conica da centrifuga per meno di 1 minuto;

-     travasare il sovranatante in un'altra provetta e centrifugare a 500 g per due minuti;

-     eliminare il sovranatante ed aggiungere soluzione fisiologica, centrifugare a 500 g per due minuti; ripetere questo punto;

-     eliminare il sovranatante ed aggiungere la soluzione di SAF (poca);

-     rimettere in sospensione il sedimento.

Allestire un preparato per l'esame diretto o eseguire una colorazione estemporanea (Lugol, Bailenger).

Il calcolo dell'accelerazione di gravità (g), in funzione del numero di giri è riportato alla voce Reagenti (R35). Per le normali centrifughe da banco di laboratorio il valore di 500 g corrisponde circa a 2000 giri/minuto.

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Metodo di concentrazione per flottazione-sedimentazione sec. Sheather per la ricerca di oocisti di Cryptosporidium.

1-   In una provetta da centrifuga contenente 7-8 ml di soluzione di saccarosio (R3) porre 0,5-1 g di feci formate (oppure 1-2 ml di feci diarroiche o 1-2 ml di feci fissate in formalina o SAF).

2-   Miscelare bene e riempire con soluzione di saccarosio sino a 1-2 mm dall'orlo della provetta.

3-   Centrifugare a 500 g per 5 minuti, fermare la centrifuga evitando vibrazioni. Per questo tipo di esame utilizzare una centrifuga a bracci oscillanti!

4-   Senza rimuovere la provetta dalla centrifuga, toccare la superficie del liquido con un ansa metallica o di plastica, ripetere più volte l'operazione depositando il liquido su di un vetrino porta oggetto.

5-   Coprire con vetrino copri oggetto.

6-   Esaminare al microscopio, preferibilmente in campo oscuro o in contrasto di fase. Con una buona esperienza è possibile identificare le oocisti di Cryptosporidium anche in campo chiaro (100x).


COLORAZIONE PERMANENTE DEGLI STRISCI FECALI

I campioni da sottoporre a colorazione permanente (feci, aspirato duodenale, campioni provenienti da retto sigmoidoscopia o altro tipo di materiale) devono essere fissati immediatamente dopo l'evacuazione, al fine di garantire la corretta morfologia e le caratteristiche tintoriali dei protozoi intestinali.

FISSAZIONE DEI CAMPIONI IN SOLUZIONE DI SCHAUDINN

Procedimento

-     Strisciare il campione su un vetrino portaoggetti con un bastoncino di plastica, vetro o legno, in modo da formare aree più spesse (rotolamento) e più sottili (strisciamento).

-     Senza lasciar asciugare, immergere immediatamente il vetrino nella soluzione di Schaudinn (R5) per almeno 1 ora (meglio una notte).

Si consiglia di procedere alla fissazione del restante materiale in SAF o PVA. Per la colorazione tricromica dei campioni fissati in soluzione di Schaudinn procedere dal punto 1(vedi sotto).

COLORAZIONE TRICROMICA (Gomori mod. Wheatley)

Allestimento dei preparati da campioni fissati in PVA

Fissare il campione (ben omogeneizzato) in soluzione di PVA per almeno 30 min. Mescolare bene, quindi prelevare 1-2 ml della sospensione con una pipetta, versarla su un foglio di carta assorbente e lasciare assorbire l'eccesso di PVA per 3 min. (non eliminare assolutamente questa fase!!). Con un bastoncino di plastica (vetro, legno) prelevare il materiale fecale dalla carta assorbente, porlo su di un vetrino portaoggetto poi, con lo stesso bastoncino, formare zone più spesse (rotolamento) e zone sottili (strisciamento) del campione. Lasciare asciugare per 2 h (minimo) in termostato a 37 °C o una notte a temperatura ambiente. I vetrini così preparati si conservano per almeno 1 mese a temperatura ambiente.

Colorazione.

Per un utilizzo saltuario (o quando si colorano pochi vetrini per volta) la colorazione può essere eseguita in vaschetta di Coplin.

Procedimento

1-     Immergere gli strisci in alcol iodato 70% per 5 min. (R14)

2-     Alcol 70% 2 min.

3-     Alcol 50% 2 min.

4-     Immergere nella soluzione tricromica non diluita per 15 min. (R15)

5-   Scolare l'eccesso di colorante su carta assorbente e immergere per qualche secondo nella soluzione decolorante (R16) (solo due immersioni !).

6-     Immergere in alcol 95%, agitando per 30 sec.

7-     Etanolo assoluto 5 min.

8-     Etanolo assoluto 5 min.

9-     Xilene 5-10 min.

Montare con balsamo sintetico o metodo alternativo (vedi sotto).

Campioni fissati in SAF

Allestimento dei preparati

1-   Fissare il campione fecale ben omogeneizzato in soluzione di SAF (R4) per almeno 30 min.

2-   Mescolare bene, prelevare 2-3 ml della sospensione e lasciare sedimentare spontaneamente in una provetta da centrifuga per meno di 1 minuto, travasare quindi il sovranatante in un'altra provetta.

3-   Riempire con soluzione fisiologica e centrifugare per 2 min a 500 g, eliminare il sovranatante; ripetere il lavaggio almeno per 4-5 volte.

4-   Dopo l'ultima centrifugazione, eliminare tutta la soluzione fisiologica.

5-   Omogeneizzare con cura con un bastoncino il sedimento lavato, prelevare una goccia di sedimento e miscelarlo con la goccia di albumina di Mayer (R17) posta in precedenza su un vetrino portaoggetto.

6-   Con lo stesso bastoncino strisciare il materiale sul vetrino portaoggetto e formare zone più spesse (rotolamento) e zone più sottili (strisciamento). Lasciare asciugare perfettamente il vetrino a temperatura ambiente, in genere un paio d'ore sono sufficienti, questo dipende dalla quantità di soluzione fisiologica presente nel sedimento, dalla quantità di albumina di Mayer, dalla temperatura ambiente e dall'umidità. Non colorare vetrini che presentino un aspetto lucido o bagnato, perché durante la colorazione il materiale potrebbe staccarsi dal vetrino. I vetrini così preparati si conservano almeno per due settimane a temperatura ambiente ed al riparo dalla polvere.

7-   Colorazione Tricromica. Procedere come per campioni fissati in PVA iniziando dal punto 2.

LETTURA E INTERPRETAZIONE DEI PREPARATI

Anche se tutte le procedure descritte sono eseguite correttamente, fattori imponderabili possono generare risultati deludenti che rendono difficile la lettura del preparato. E' quindi indispensabile, ogni qual volta si procede ad una colorazione permanente, inserire un vetrino di controllo contenente protozoi noti (preferibile un campione contenente Dientamoeba fragilis, per la peculiarità della fine struttura nucleare). Tuttavia i vetrini di controllo conservati per parecchio tempo possono disidratarsi (l'umidità del campione è trattenuta dalla glicerina contenuta nell'albumina di Mayer). Ne deriva una debole colorazione del vetrino di controllo positivo. In mancanza di campioni con protozoi noti, si può allestire un controllo utilizzando un campione di feci negativo fissato in PVA o SAF, cui viene aggiunto un buffy coat di globuli bianchi.

Osservare il preparato a piccolo ingrandimento (obiettivo 40x) individuando le zone con spessore uniforme per avere una valutazione d'insieme del risultato della colorazione. Procede quindi all'osservazione in immersione (obiettivo100x), esaminare almeno 300 campi microscopici prima di considerare il campione negativo.

Risultati:

-     nei preparati ben colorati le caratteristiche cromatiche degli organismi spiccano contro il fondo del preparato e li rendono più facilmente visibili rispetto alla colorazione con ematossilina;

-     il citoplasma dei trofozoiti è blu-verde o verde, in alcuni casi con sfumature porpora;

-     le cisti di Entamoeba coli, assumono una colorazione rosso-porpora più intenso rispetto a quelle di Entamoeba histolytica/dispar/moshovskii e di altre amebe;

-     le cisti sono spesso circondate da un alone chiaro poiché si restringono durante il processo di fissazione: per conoscere la dimensione della cisti si deve misurare il diametro dell'alone che comprende al suo interno la cisti;

-     la cromatina nucleare, il cariosoma e le inclusioni (corpi cromatoidi, globuli rossi, batteri) si colorano in rosso o rosso-porpora, come pure le fibrille dei flagellati;

-     i cristalli di Charcot-Leyden si colorano di rosso;

-     i lieviti e le Blastocystis si colorano di verde, quest'ultimi con i nuclei rossi disposti sul sottile anello di citoplasma;

-     i vacuoli e le masse di glicogeno non si colorano, dove era presente si noterà una zona chiara.

La colorazione tricromica fornisce i migliori risultati utilizzando campioni fissati in soluzione di Schaudinn o PVA; l'utilizzo di campioni fissati in SAF può dare risultati deludenti.

NOTE RIGUARDANTI LA COLORAZIONE TRICROMICA

-     I preparati possono rimanere nelle soluzioni al punto 2,8,9 per 24 ore senza che ne risulti alterata la qualità della colorazione.

-     La rimozione del cloruro mercurico dai campioni fissati in Schaudinn o PVA avviene ad opera della soluzione iodo-alcolica. Tale soluzione dev'essere rinnovata settimanalmente o quando il suo colore tende a schiarire: in caso contrario si forma un precipitato di cristalli o granuli altamente rifrangenti che ostacolano l'osservazione del preparato.

-     La rimozione incompleta dello iodio causa una colorazione predominante verde del preparato. Sostituire frequentemente la soluzione di etanolo 70% o allungare il tempo di questo passaggio.

-     Il passaggio dal punto 3 al punto 4 della colorazione può causare il trascinamento di alcol nel colorante tricromico, che ne risulta diluito. Per evitare questo, drenare l'eccesso di alcol su carta assorbente.

-     Per verificare la qualità della soluzione colorante, inclinare leggermente la vaschetta e osservare se il bordo bagnato è di colore rosso (buono), in caso contrario per rigenerare la soluzione, lasciare scoperta la vaschetta per una notte allo scopo di far evaporare l'alcol eventualmente presente; riportare quindi al livello originale con colorante tricromico nuovo.

-     Sebbene la colorazione tricromica sia una colorazione progressiva, i migliori risultati si ottengono come colorazione regressiva, utilizzando cioè una soluzione decolorante. Una decolorazione eccessiva (è molto facile differenziare troppo - punto 5) causa una scarsa differenziazione dei parassiti anche se il resto del preparato si colora bene. Ad esempio l'aspetto granulare della cromatina nucleare di Dientamoeba fragilis può essere difficilmente rilevabile e generare confusione con altre specie di ameba (es. Entamoeba hartmanni ). Al contrario in campioni sovracolorati (poco differenziati), la cromatina nucleare può essere compatta, non formata da granuli ed in questo caso simile a quella di Endolimax nana o Iodamoeba buetschlii

-     Nella fase finale della disidratazione l'alcol etilico dev'essere assoluto, cioè totalmente privo di acqua: se - dopo il passaggio dall'alcol etilico assoluto allo xilene - quest'ultimo diviene opaco, ripassare il vetrino in etanolo assoluto fresco e successivamente in xilene fresco.

-     Se il risultato della colorazione è insoddisfacente ed è impossibile ottenere un nuovo campione, ricolorare i vetrini procedendo in questo modo:

o  immergere il vetrino montato con balsamo sintetico in xilene per almeno 12-24 ore, fino al distacco del coprioggetto;

o  passare in successione in alcol etilico assoluto (1min.), alcol 95% (1min.), alcol 70% (1 min.) ed infine in alcol 50% (1 min.);

o  decolorare il preparato in acido acetico 10% per parecchie ore;

o  lavare con acqua di fonte per 3 min. (rinnovare almeno 4-5 volte);

o  passare in successione in alcol 70% (1 min.) e alcol 50% (1 min.);

o a questo punto si può ripetere la colorazione tricromica dal punto 4.

Se si desidera osservare ad immersione il preparato subito dopo la colorazione, senza passare al montaggio permanente - che comporta un'attesa di almeno 24-36 ore per l'essiccamento - si può optare per un metodo alternativo e rinviare il montaggio permanente successivamente.

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Metodo alternativo

-     Togliere il campione dallo xilene e lasciarlo asciugare perfettamente in posizione orizzontale.

-     Depositare alcune gocce di olio per immersione sul preparato, lasciarlo diffondere uniformemente e attendere circa 10 min.

-     Coprire con un coprioggetto di dimensioni opportune, aggiungere ancora una goccia di olio ed esaminare a immersione (obiettivo 100 x).

Non esaminare campioni privi di coprioggetto! Dopo la disidratazione, il materiale fecale strisciato diviene infatti molto friabile. Inoltre, in assenza del coprioggetto di protezione, la lente frontale dell'obiettivo a immersione potrebbe subire danni irreparabili. La trasparenza e la brillantezza del preparato risultano comunque inferiori a quelle ottenute con il montaggio permanente.

COLORAZIONE CON FERRO EMATOSSILINA

L'ematossilina è un colorante naturale estratto dal legno di Hematoxylon campechianum; si presenta in forma di cristalli incolori privi di potere colorante, che viene acquisito dopo ossidazione e trasformazione in emateina.

Esistono numerosi metodi di colorazione, quelli regressivi sono lunghi e richiedono una buona esperienza, soprattutto nella fase di differenziazione (decolorazione). Il preparato dev'essere osservato più volte al microscopio allo stato "bagnato", allo scopo di seguire il processo di decolorazione / differenziazione. Il procedimento permette tuttavia di mettere in evidenza i più fini dettagli citologici, con risultati eccellenti. I metodi progressivi sono invece rapidi, non richiedono la differenziazione del preparato e forniscono una colorazione nucleare sufficiente per l'identificazione di specie delle amebe.

Allestimento dei preparati

Campioni fissati in soluzione di Schaudinn (vedi colorazione tricromica)

Campioni fissati in SAF (vedi colorazione tricromica)

Campioni fissati in PVA (vedi colorazione tricromica)

La colorazione con ferro ematossilina fornisce ottimi risultati con campioni fissati in SAF o soluzione di Schaudinn.

Colorazione con ematossilina ferrica di Heidenhain (metodo regressivo)

Per un utilizzo occasionale - o quando si colorano pochi vetrini per volta - la colorazione viene eseguita in vaschette di Coplin.

Per campioni fissati in soluzione di Schaudinn procedere dal punto 1.

Per campioni fissati in PVA procedere dal punto 1.

Per campioni fissati in SAF procedere dal punto 2.

Procedimento:

1-     Immergere gli strisci in alcol iodato 70% per 5 min. (R14)

2-     Alcol 70% 5 min.

3-     Alcol 50% 2 min.

4-     Lavare bene con acqua distillata.

5-     Soluzione di lavoro di ematossilina 10 min. (R20).

6-     Acqua corrente (meglio tiepida) 10 min.

7-     Differenziare i vetrini (uno alla volta) in soluzione decolorante (R21) o (R22) per 30 sec.

8-     Lavare con acqua di fonte e controllare al microscopio (obiettivo 40x) il vetrino bagnato: se il risultato non è soddisfacente, riportare il vetrino in soluzione decolorante e dopo in acqua di fonte, sino a ottenere il risultato desiderato. Se la differenziazione nella soluzione decolorante è eccessiva (vetrino troppo scolorato e poco differenziato), ricolorare con ematossilina partendo dal punto 5.

9-     Acqua corrente (meglio tiepida) 10 min.

10-     Alcol 95% 5 min.

11-     Alcol etilico assoluto 5 min.

12-     Alcol etilico assoluto 3 min.

13-     Xilene 5-10 min.

Montare con liquido di montaggio sintetico o utilizzare il metodo alternativo (v. sopra).

Durante tutte le fasi della colorazione il vetrino non deve rimanere mai asciutto!!!

LETTURA E INTERPRETAZIONE DEI PREPARATI

-     La colorazione dei parassiti tende dal blu al nero, a seconda della maturità della soluzione di lavoro dell'ematossilina;

-     il citoplasma dei trofozoiti è blu scuro, grigio o nero;

-     le cisti assumono un colore blu scuro, grigio o nero e molto spesso appaiono circondate da un alone chiaro, di cui si deve tener conto nel caso si dovesse misurare il diametro della cisti;

-     la cromatina nucleare periferica, il cariosoma e le inclusioni (corpi cromatoidi, globuli rossi, batteri) si colorano in blu scuro, grigio o nero, così come le fibrille dei flagellati;

-     i cristalli di Charcot-Leyden si colorano di nero;

-     i lieviti e le Blastocystis si colorano di blu scuro grigio o nero, queste ultime con i nuclei più scuri sul sottile anello di citoplasma;

-     il glicogeno non si colora, ma dove era presente si osserva una zona chiara.

Esaminare almeno 300 campi microscopici (obiettivo 100x) prima di considerare negativo il campione.

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Colorazione con ematossilina di Mayer (metodo progressivo rapido)

Pur non fornendo la stessa qualità di risultati rispetto al metodo regressivo, il metodo progressivo rapido può costituire una valida alternativa per i principianti.

Allestimento dei preparati (vedi in precedenza).

Colorazione.

1-     Immergere il preparato per 5 min., in alcol etilico 70%, 1 min. in alcol 50%.

2-     Lavare in acqua di fonte per 5 min.

3-     Due lavaggi rapidi in acqua distillata.

4-     Immergere in una vaschetta contenente ematossilina di Mayer (R23) per 40 sec. Questo tempo deve essere controllato per ogni nuova preparazione di ematossilina.

5-     Lavare con acqua corrente per 5 min.

6-     Immergere per 30 sec. in una soluzione di acqua e ammoniaca (R24).

7-     Passare in alcol etilico 95% per 1 min.; secondo passaggio in un'altra vaschetta, sempre con alcol 95% per 30 sec.

8-     Disidratare in alcol etilico assoluto per 5 min.

9-     Xilene 5-10 min.

10-     Montare con balsamo sintetico o procedere con il metodo alternativo.

Durante tutte le fasi della colorazione il vetrino non deve rimanere mai asciutto !!!

Con questo metodo i parassiti sono colorati in blu.

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OSSERVAZIONI RIGUARDANTI LA COLORAZIONE TRICROMICA E CON EMATOSSILINA

Queste colorazioni sono utilizzate per facilitare il riconoscimento e l'identificazione delle forme vegetative di protozoi intestinali (amebe, flagellati ). In campioni contenenti cisti i risultati possono essere deludenti, per la presenza di forme collassate, deformate o ipercolorate. Questo non dipende da una cattiva colorazione, ma dal fatto che le cisti si fissano male, sia con la soluzione di Schaudinn che con PVA o SAF.

Per quanto riguarda le forme vegetative, al momento della fissazione esse si possono trovare o in uno stato di riposo (interfase) o in una delle fasi della divisione cellulare; non è quindi raro osservare forme contenenti 2 nuclei o un nucleo apparentemente deformato in via di divisione (anafase).

Vedi Divisione della forme vegetative di amebe.

COLORAZIONE DI GIEMSA O FIELD

Queste colorazioni sono eseguite solo su campioni freschi non fissati (feci, aspirato duodenale ecc.), con lo scopo di identificare i trofozoiti di Dientamoeba fragilis o di flagellati (eccellenti risultati). Altri protozoi intestinali sono di difficile o impossibile identificazione.

Colorazione di Giemsa

Allestimento dei preparati

1-     Strisciare il campione su un vetrino portaoggetto in modo da ottenere un preparato sottile; se le feci sono di consistenza normale, diluirle con soluzione fisiologica (mai con acqua !).

2-     Asciugare all'aria.

3-     Fissare con alcol metilico per 1 minuto.

4-     Asciugare all'aria.

Procedimento

1-     Immergere il preparato nella soluzione di Giemsa al 10% (R33) per 30 minuti.

2-     Lavare bene con acqua di fonte.

3-     Asciugare all'aria.

Esame microscopico

Depositare alcune gocce di olio per immersione sul preparato, lasciar diffondere in modo uniforme e attendere circa 10 min; a questo punto coprire con un coprioggetto di dimensioni opportune, aggiungere una goccia di olio per immersione ed esaminare con obiettivo 100 x. Non esaminare campioni privi di coprioggetto di protezione, in quanto la lente frontale dell'obiettivo ad immersione potrebbe danneggiarsi.

Interpretazione

-     Citoplasma azzurro o azzurro-grigio.

-     Nucleo o nuclei rosso-porpora o viola.

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Colorazione di Field

Allestimento dei preparati (vedi colorazione di Giemsa)

Colorazione

1-     Con una pipetta versare sul vetrino 1ml. di Field B (diluito 1+4 con acqua distillata).

2-     Aggiungere immediatamente 1ml. di Field A e con la stessa pipetta miscelare i due coloranti.

3-     Colorare per 1 minuto.

4-     Lavare bene con acqua di fonte e asciugare all'aria.

Lettura e interpretazione (vedi colorazione di Giemsa)

COLORAZIONE DI ZIEHL-NEELSEN Mod. (metodo a caldo)

E' una colorazione che mette in evidenza l' acido resistenza dei coccidi intestinali.

Procedimento

1-     Il campione fecale va strisciato in modo da ottenere uno strato sottile. Utilizzare feci fissate in formalina o SAF, o dopo concentrazione (in quest'ultima per il recupero delle oocisti di Cryptosporidium tutte le fasi di centrifugazione devono essere protratte almeno per 10 min. a 500 x g).

2-     Lasciar asciugare all'aria.

3-     Fissare gli strisci con metanolo per 1 min

4-     Lasciar asciugare.

5-     Coprire il vetrino con carbol-fucsina (R25) per 5 minuti, riscaldando gentilmente su becco Bunsen o lampada ad alcol. Evitare l'ebollizione della soluzione colorante o il suo essiccamento; in questo ultimo caso aggiungere altro colorante sul preparato.

6-     Decolorare con la soluzione acida (R26) sino a che il colore (rosso-rosa) cessa di colare dal vetrino.

7-     Lavare bene con acqua di fonte.

8-     Coprire il preparato con una soluzione di blu di metilene (R27) per 30 sec.

9-     Lavare con acqua di fonte, lasciar asciugare all'aria.

Lettura e interpretazione

Esaminare i vetrini al microscopio (40x e 100x). Le oocisti assumono una colorazione variabile che va dal rosa, al rosso e al porpora intenso.

Cryptosporidium: all'interno dell'oocisti, di forma rotondeggiante od ovale, sono visibili formazioni puntiformi o a "virgola" di colore nero (sporozoiti); il colore rosso intenso delle oocisti spicca sul fondo blu del preparato.

Isospora: nelle oocisti mature sono visibili 2 sporocisti colorate in rosso, contornate da un alone chiaro che le separa dalla parete dell'oocisti.

Cyclospora: in media solo 1 oocisti su 4 assume il colore e appare tinta dal rosso al rosa; le restanti oocisti appaiono come "fantasmi" rotondeggianti e incolori. Per colorare tutte le oocisti si può utilizzare un metodo di colorazione con safranina che richiede però l'utilizzo di un forno a microonde.

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COLORAZIONE DI KYNIOUN (metodo a freddo)

E' una colorazione che mette in evidenza l' acido resistenza dei coccidi intestinali..

Procedimento

1-     Il campione fecale va strisciato in modo da ottenere uno strato sottile. Utilizzare feci fissate in formalina o SAF, o dopo concentrazione (in quest'ultima per il recupero delle oocisti di Cryptosporidium tutte le fasi di centrifugazione devono essere protratte almeno per 10 min. a 500 x g).

2-     Lasciar asciugare all'aria.

3-     Fissare gli strisci con metanolo per 1 min.

4-     Lasciar asciugare.

5-     Coprire il vetrino con carbol-fucsina di Kinyoun (R28) per 5 min.

6-     Decolorare con soluzione acida (R29) sino a che il colore (rosso-rosa) cessa di colare dal vetrino.

7-     Lavare bene con acqua di fonte.

8-     Coprire il preparato con una soluzione di blu di metilene (R30) per 30 sec.

9-     Lavare con acqua di fonte, lasciar asciugare all'aria.

Lettura e interpretazione

Esaminare i vetrini al microscopio (40x e 100x). Le oocisti assumono un colore variabile che va dal rosa al rosso porpora intenso, ma con un aspetto meno brillante che nella colorazione di Ziehl-Neelsen mod.

COLORAZIONE TRICROMICA DI WEBER PER MICROSPORIDI

Procedimento

-     Preparare uno striscio sottile con 10 μl. di feci fissate in formalina al 10% o SAF. Non si possono utilizzare campioni di feci concentrati con il metodo di Ritchie.

-     Fissare per 10 minuti in alcol metilico e lasciar asciugare.

Colorazione:

1-     immergere lo striscio per 90 minuti nella soluzione tricromica modificata (R31);

2-     decolorare nella soluzione alcol acida per 5-10 sec. (R32);

3-     risciacquare brevemente in alcol etilico 95% per 2-4 secondi (2 tuffi);

4-     disidratare mediante 2 passaggi in alcol etilico assoluto di 5 minuti;

5-     immergere in xilene per 5 minuti (2 volte);

6-     montare con balsamo sintetico o procedere con il metodo alternativo.

Lettura ed interpretazione

Esaminare con molta attenzione almeno 300 campi microscopici con obiettivo ad immersione (obiettivo 100 x). Le spore di microsporidi sono rifrangenti, di forma ovale, con la parete di colore rosso rosa ma, a causa delle piccole dimensioni, l'identificazione è spesso difficoltosa. Talvolta il contenuto della spora non si colora affatto, in altri casi è possibile apprezzare una banda diagonale o equatoriale rosso rosata. Il fondo del preparato, costituito da residui fecali e batteri, si colora debolmente in verde. Per non incorrere in interpretazioni errate, è indispensabile disporre di un campione positivo di controllo.

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COLORAZIONE DI GIEMSA PER MICROSPORIDI

Allestimento dei preparati (vedi colorazione tricromica di Weber per microsporidi)

colorazione

1-     Immergere i vetrini fissati nel colorante di Giemsa (R33) per 35 min.

2-     Lavare con acqua corrente per 30 sec;

3-     Lasciar asciugare.

Lettura e interpretazione del preparato

Esaminare con molta attenzione almeno 300 campi microscopici con obiettivo ad immersione (obiettivo 100x). Se presenti, le spore di microsporidi appaiono isolate o a gruppi. Il nucleo è colorato in rosso, il citoplasma blu pallido; si nota la presenza di un vacuolo intracitoplasmatico chiaro. Per non incorrere in interpretazioni errate, è indispensabile disporre di un campione positivo di controllo.

RICERCA MICROSCOPICA IN FLUORESCENZA DELLE OOCISTI DI COCCIDI

Le oocisti di coccidi (Cyclospora, Isospora, Sarcocystis, Toxoplasma, ma non Cryptosporidium) manifestano un'autofluorescenza spontanea di colore blu, se esposte a radiazioni di lunghezza d'onda inferiore a 400 nm. Si deve tuttavia tener presente che i microscopi provvisti di lampada al quarzo-iodio non emettono radiazioni UV al di sotto di 400 nm, pertanto l'autofluorescenza delle oocisti non è rilevabile. Al contrario, quelli forniti di lampade a vapori di mercurio o di xenon emettono radiazioni UV al di sotto dei 400 nm, ma l'autofluorescenza delle oocisti è rilevabile solo se è presente un filtro di eccitazione da 340-380 nm.

Allestimento dei preparati 

Possono essere esaminate feci fresche, fissate in formalina al 10% o SAF, o concentrate.

Procedimento

1.     Porre su un vetrino portaoggetto alcune gocce di sospensione fecale, coprire con coprioggetto di dimensioni adeguate.;

2.     Esaminare con microscopio a fluorescenza (obiettivo 10 x o 40 x), inserendo il filtro di eccitazione da 340-380 nm.

Interpretazione

Le oocisti Le oocisti conservano la loro normale morfologia, l'interno è di colore azzurro chiaro mentre la loro parete mostra una spiccata fluorescenza blu.

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